Ciencias

Tecnología Light-Seq para código de barras y secuenciación profunda de poblaciones de células seleccionadas en tejidos

Bajo el microscopio, los investigadores a menudo observan diferentes tipos de células que se organizan en patrones peculiares dentro de los tejidos o, a veces, un tipo de célula poco común que se destaca por ocupar una posición única, mostrar una forma inusual o expresar una molécula biomarcadora específica. Para determinar el significado más profundo de sus observaciones, desarrollaron enfoques para acceder también a los patrones de expresión de genes celulares (transcriptomas) mediante el análisis de las moléculas de ARN derivadas de los genes presentes en ellos, que pueden coincidir con las formas, las posiciones espaciales y las moléculas moleculares de la célula. biomarcadores.

Sin embargo, estos enfoques de «transcriptómica espacial» todavía capturan solo una fracción de las moléculas de ARN totales de una célula y no pueden proporcionar la profundidad y calidad de análisis que brindan los métodos de secuenciación de una sola célula, que se desarrollaron para investigar los transcriptomas de células individuales aisladas de tejidos o biofluidos a través de la Técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS). Tampoco permiten que los investigadores se centren únicamente en células específicas en función de su ubicación en un tejido, lo que facilitaría mucho la búsqueda de poblaciones de células inconexas o células raras y difíciles de aislar, como células cerebrales raras con funciones únicas. o células inmunitarias. células que invaden los tumores. Además, debido a que se altera el entorno del tejido original, muchos métodos de transcriptómica espacial y todos los métodos de secuenciación de una sola célula impiden que los investigadores vuelvan a examinar sus muestras para análisis de seguimiento y son costosos porque requieren instrumentos o reactivos especializados.

Un nuevo avance realizado en el Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada de la Universidad de Harvard ahora supera estas limitaciones con un método basado en nanotecnología de ADN llamado «Light-Seq». Light-Seq permite a los investigadores «etiquetar geográficamente» todo el repertorio de secuencias de ARN con códigos de barras de ADN únicos para algunas células de interés. Estas células objetivo se seleccionan usando luz bajo un microscopio. a través de la un proceso de fotocruce rápido y eficaz.

Con la ayuda de una nueva nanotecnología de ADN, las secuencias de ARN con código de barras se traducen luego en hebras de ADN coherente, que se pueden recolectar de la muestra de tejido e identificar mediante NGS. El proceso Light-Seq se puede repetir con diferentes códigos de barras para diferentes poblaciones de células dentro de la misma muestra, que se deja intacta para el análisis de seguimiento. Con un rendimiento comparable a los métodos de secuenciación de células individuales, amplía significativamente la profundidad y el alcance de las investigaciones posibles en una muestra de tejido. El método está publicado en Métodos de la naturaleza .

«La combinación única de capacidades de Light-Seq responde a una necesidad insatisfecha: la capacidad de realizar análisis de secuenciación profunda espacialmente prescritos e informados por imágenes de poblaciones de células difíciles, si no imposibles, o tipos de células raras en tejidos preservados, con una correspondencia de sus características altamente refinadas. estado de expresión génica con características espaciales, morfológicas y potencialmente relevantes para la enfermedad», dijo Peng Yin, Ph.D., uno de los cuatro autores correspondientes y miembro del cuerpo docente del Instituto Wyss, donde su grupo desarrolló Light-Seq. «Por lo tanto, tiene el potencial de acelerar el proceso de descubrimiento biológico en varias áreas de la investigación biomédica». Yin también es profesor de Biología de Sistemas en la Facultad de Medicina de Harvard (HMS).

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Desde código de barras en el lugar secuenciar ex situ

El proyecto Light-Seq fue dirigido por Jocelyn (Josie) Kishi, Ph.D., Sinem Saka, Ph.D., y Ninning Liu, Ph.D. en el grupo de Yin en Wyss, y Emma West, Ph.D. en el laboratorio de Constance Cepko en HMS. Anteriormente, Kishi y Saka habían desarrollado SABER-FISH como un método de transcriptómica espacial para expresar genes de imágenes directamente en tejidos intactos.en el lugar). «Con SABER-FISH, todavía estábamos muy lejos de capturar los programas completos de expresión génica de las células, con muchos miles de moléculas de ARN diferentes por célula», dijo Kishi, coprimero y coautor correspondiente. «Light-Seq resuelve este problema al combinar el etiquetado de códigos de barras de alta resolución con la secuenciación completa del transcriptoma a través de NGS, lo que nos brinda lo mejor de ambos mundos e importantes ventajas adicionales». En el momento del estudio, Kishi era becario de desarrollo tecnológico de Wyss en el equipo de Yin y ahora está siguiendo un camino para comercializar Light-Seq junto con algunos de sus coautores.

«Para secuenciar específicamente células en ubicaciones personalizadas seleccionadas a partir de muestras de tejido intactas, desarrollamos un enfoque novedoso para fotorreticular códigos de barras de ADN con copias de moléculas de ARN y un procedimiento basado en nanotecnología de ADN que los convierte a ellos y a sus secuencias de ARN en archivos adjuntos legibles por NGS», dijo el co -primer autor Liu, un postdoctorado en el grupo de Yin que previamente co-desarrolló una plataforma de código de barras de ADN paralelizado para un método de imágenes de súper resolución llamado «Action-PAINT», que también se convirtió en un componente clave de Light-Seq.

En primer lugar, los cebadores de ADN se «emparejan» con moléculas de ARN en las células y se extienden para crear copias de secuencias de ARN denominadas secuencias de ADN complementarias (ADNc). Luego, las hebras de código de barras de ADN que contienen un nucleótido fotorreticulante ultrarrápido se emparejan, a su vez, con los ADNc en las células. Estos se encienden permanentemente cuando una célula objetivo se ilumina bajo el microscopio a través de un dispositivo óptico similar a una plantilla que mantiene en la oscuridad a otras células que no son objetivo en el campo microscópico y, por lo tanto, las protege de la reacción de fotocruce. Después de lavar secuencias de ADN con código de barras de células que no estaban unidas permanentemente en el lugarel procedimiento se puede repetir con diferentes códigos de barras y patrones de luz para etiquetar más regiones de interés.

«Para poder integrar este flujo de trabajo de código de barras con NGS, diseñamos una nueva reacción de unión basada en nanotecnología de ADN. Esta innovación nos permite convertir nuestros ADNc de código de barras en secuencias de lectura contiguas. Luego podemos extraer la colección completa de secuencias de ADNc de muestra de código de barras. y analizarlos con técnicas NGS estándar», explicó Saka, uno de los autores correspondientes del estudio que actualmente es líder de grupo en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania. «En última instancia, cada código de barras rastrea la lectura del transcriptoma completo hasta las células preseleccionadas en la muestra de tejido, que permanece intacta para los análisis posteriores. Esto nos brinda la oportunidad única de volver a visitar exactamente las mismas células después de la secuenciación para su validación o exploración adicional».

Vigilando tejidos complejos y células raras

Después de la primera validación de Light-Seq en células cultivadas, el equipo de Yin quería aplicarlo a un tejido complejo y, en colaboración con el grupo de Constance Cepko, Ph.D. en HMS. Cepko es uno de los autores correspondientes del estudio y profesor de genética y neurociencia de Bullard en el Instituto Blavatnik del HMS, e investiga el desarrollo de la retina como modelo del sistema nervioso. Kishi, Saka y Liu unieron fuerzas con West en el grupo de Cepko para aplicar Light-Seq a secciones transversales de retinas de ratón y perfilar tres capas principales con diferentes funciones. Los investigadores lograron una cobertura de secuencia comparable a los métodos de secuenciación de una sola célula y descubrieron que miles de ARN estaban enriquecidos entre las tres capas principales de la retina. También demostraron que, después de la extracción de la secuencia, las muestras de tejido permanecían intactas y podían visualizarse en busca de proteínas y otras biomoléculas.

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«Al llevar Light-Seq al extremo, pudimos aislar el transcriptoma completo de un tipo de célula muy raro conocido como ‘células amacrinas dopaminérgicas’ (DAC), que son extremadamente difíciles de aislar debido a sus intrincadas conexiones con otras células en la retina, recuperando solo de cuatro a ocho células codificadas individualmente por sección transversal», dijo West. Los DAC están involucrados en la regulación del ritmo circadiano del ojo, ajustando la percepción visual a diferentes exposiciones de luz durante el ciclo día-noche. “Light-Seq también capturó ARN que se expresaron específicamente en DAC en niveles bajos, así como docenas de ARN de biomarcadores específicos de DAC que, hasta donde sabemos, no se habían descrito antes, lo que abre nuevas oportunidades para estudiar este tipo de célula poco común. . ”, agregó West, quien en el momento del estudio era un estudiante graduado y luego un becario postdoctoral en Cepko, y ahora se unió a Kishi en su esfuerzo de comercialización de Light-Seq.

Abrir el campo de la transcriptómica espacial a NGS también agrega información sobre el nivel de una sola especie de ARN. «Nuestros datos de secuenciación mostraron claramente que Light-Seq puede determinar variaciones naturales en la estructura de los ARN. En el futuro, estamos muy interesados ​​en usar Light-Seq para comprender mejor la interacción entre el sistema inmunitario, las células que propagan enfermedades y diferentes estrategias.» terapias como la terapia génica y celular», dijo Kishi.

La tecnología Light-Seq desarrollada en el grupo de Peng Yin en la Iniciativa de Robótica Molecular en el Instituto Wyss muestra una vez más cómo la búsqueda de un enfoque totalmente poco convencional y el aprovechamiento de la biología sintética pueden conducir a una tecnología disruptiva con un gran potencial para el avance de la medicina fundamental y clínica».


Donald Ingber, MD, Ph.D., director fundador de Wyss

Donald Ingber es también el Judah Folkman Profesor de Biología Vascular en la Escuela de Medicina de Harvard y el Hospital de Niños de Boston, y el Hansjörg Wyss Profesor de Ingeniería Bioinspirada en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard.

Fuente:

Referencia del periódico:

Kishi, JY, et al. (2022) Light-Seq: Código de barras in situ dirigido por luz de biomoléculas en células y tejidos fijados para secuenciación indexada espacialmente. Métodos de la naturaleza. doi.org/10.1038/s41592-022-01604-1.

Prudencia Febo

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