Descubierto un nuevo mecanismo de empalme para intrones cortos

Los investigadores confirman que el mecanismo de empalme pre-ARNm establecido que aparece en los libros de texto no puede funcionar en un subconjunto de intrones cortos humanos: se ha descubierto un nuevo empalme dependiente del complejo SAP30BP-RBM17.

Se ha considerado que el conocido heterodímero esencial del factor de empalme pre-ARNm U2AF (U2AF2 – U2AF1) media la reacción de empalme temprana en todos los intrones de diferentes longitudes. Sin embargo, el Dr. Kazuhiro Fukumura, del laboratorio Akila Mayeda de la Universidad de Salud de Fujita, descubrió que un subconjunto de intrones cortos con tractos de polipirimidina truncados están empalmados por el complejo RBM17-SAP30BP en lugar del heterodímero U2AF. Propusieron un mecanismo único en el que SAP30BP dirige a RBM17 para activar los esplicosomas tempranos.

En los seres humanos, la longitud del pre-ARNm varía mucho (de 30 a 1.160.411 nucleótidos en estudios recientes). El mecanismo fundamental del empalme se estudió con modelos de pre-ARNm que incluyen intrones de 158 y 231 nt, por ejemplo históricos, que se empalman de manera muy eficiente in vitro e in vivo. Este pre-ARNm ideal contiene buenas secuencias señal de empalme, es decir, el sitio de empalme 5', la secuencia del sitio de ramificación (BS) y el tracto de polipirimidina (PPT), seguido del sitio de empalme 3' que son reconocidos por U1 snRNP, U2 snRNP. y U2AF2 – U2AF1, respectivamente. El profesor Mayeda dice: “Dadas las diferentes longitudes de los intrones humanos, es probable que exista más de un mecanismo. Ésta es nuestra motivación para comenzar nuestro estudio de empalme centrado en intrones cortos humanos”.

Nuestra investigación anterior sobre el proceso de empalme en el intrón corto reveló que el factor de empalme auténtico U2AF2 no puede unirse al PPT truncado y, por lo tanto, RBM17 es reemplazado por U2AF para promover el empalme. Sabes, esto es razonable porque los intrones cortos suelen ser demasiado compactos para una longitud suficiente de PPT. Publicamos este hallazgo en 2021. Sin embargo, RBM17 no puede unirse al PPT truncado in vitro, por lo que no sabíamos cómo RRM17 reconoce el PPT truncado y el siguiente sitio de empalme 3'. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que otro factor proteico está implicado en el empalme dependiente de RBM17”.

Dr. Kazuhiro Fukumura, Universidad de Salud de Fujita

El grupo de Mayeda acabó identificando este cofactor proteico detrás del empalme dependiente de RBM17, que es SAP30BP. Su estudio fue publicado en el volumen 42, número 12 de la revista Cell Reports el 7 de diciembre de 2023.

El Dr. Fukumura afirma: “Era fundamental investigar referencias anteriores. A partir de tres artículos, me convencí de que SAP30BP es el candidato más fuerte para el cofactor de RBM17”. Demostraron que la existencia de SAP30BP en el complejo de empalme temprano humano, SAP30BP y RBM17 de la mosca de la fruta se detectaron en el espliceosoma de mosca formado en un intrón corto, y el vínculo entre SAP30BP y RBM17 se detectó mediante un análisis de dos híbridos de levadura. “Actualmente, el agotamiento de SAPBP mediado por ARNip en la línea celular humana es la forma más fácil y directa de probar la represión del empalme dependiente de RBM17. ¡Y fue bingo! dice la Dra.

Las transcripciones en células humanas empobrecidas en SAP30BP se analizaron mediante un secuenciador de próxima generación (análisis RNA-Seq) y se encontraron muchos intrones dependientes de RBM17 y SAP30BP. Estos intrones se distribuyeron en el intervalo más corto y el PPT truncado fue de hecho un determinante crítico de la dependencia de RBM17/SAP30BP. Por tanto, RBM17 y SAP30BP son los factores de empalme generales.

El profesor Mayeda comenta: «Fue una feliz coincidencia que el profesor Michael Sattler, experto en análisis estructural, estuviera profundamente interesado en nuestro estudio y pudimos iniciar una colaboración productiva». Las interacciones proteína-proteína a través del enlace UHM (motivo de homología U2AF)-ULM (motivo de ligando UHM) desempeñan funciones esenciales en las reacciones generales de empalme. El laboratorio de Sattler encontró una secuencia ULM oculta en SAP30BP y demostró que era fundamental para interactuar con UHM en RBM17 mediante análisis de RMN (resonancia magnética nuclear) e ITC (calorimetría de titulación isotérmica).

Sin embargo, el papel de la interacción RBM17-SAP30BP sigue siendo enigmático. Como RBM17 tiene solo un UHM, el enlace RBM17-SAP30BP debe liberarse antes de que RBM17 interactúe con SF3B1, un componente del snRNP U2, que es esencial para promover el empalme. Entonces, ¿cuál es el papel de la interacción RBM17 – SAP30BP? El profesor Mayeda dice: «Fukumura diseñó un ensayo de unión inteligente utilizando anticuerpos anti-fosfo-SF3B1 para abordar esta curiosa pregunta, y podríamos proporcionar un modelo de trabajo elegante (ver figura IMAGEN)». Proponemos que el complejo intermedio RBM17-SAP30BP previene la unión no funcional de RBM17 al SF3B no fosforilado libre, lo que promueve la unión funcional de RBM17 al SF3B1 fosforilado activo en el pre-ARNm.