La capsaicina induce la ferroptosis del NSCLC al regular la señalización de SLC7A11/GPX4 in vitro

Ensayo de cultivo celular y MTT

Las células A549 y NCI-H23 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Cultivamos estos dos tipos de células con medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) y suero fetal bovino al 10 % (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) en un ambiente humidificado al 5 %. CO_dos a 37°C.

Las células A549 y NCI-H23 (1 × 10⁴ células/pocillo) se cultivaron respectivamente en placas de 96 pocillos y se trataron con concentraciones de 0, 50, 100, 200 y 300 μM de capsaicina (A10178, AdooQ) durante 24 y 48 h. Después del tratamiento con capsaicina, se añadió MTT (5 mg/mL en PBS, 10 µL, Sigma-Aldrich) a cada pocillo y se cultivó a 37 ℃ durante 3 h sin luz. Luego, se descartó el sobrenadante y los cristales de formazán formados se disolvieron en 100 μL de dimetilsulfóxido al 100 % (DMSO, Sigma-Aldrich). Finalmente, se detectó la absorbancia a 570 nm utilizando el analizador (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Los valores IC50 para células A549 y NCI-H23 tratadas con capsaicina se determinaron para los siguientes estudios. Para diferenciar la apoptosis y la ferroptosis, usamos ferrostatina-1 (Fer-1, un supresor de ferroptosis, Sigma-Aldrich, 1 μM) y Z-VAD-FMK (ZVF, un supresor de apoptosis, Sigma-Aldrich, 100 μM), y observamos cambios en la viabilidad de las células A549 y NCI-H23, respectivamente. Las concentraciones de Fer-1 y ZVF aquí se decidieron de acuerdo con informes anteriores.^21.22.

Después de confirmar los valores IC50 de las células A549 y NCI-H23, las células se dividieron en 3 grupos respectivamente para las siguientes investigaciones: (1) grupo de control, (2) grupo de capsaicina, (3) grupo de capsaicina + ferrostatina-1.

Detección de concentración de hierro

Detectamos niveles de hierro total en cada grupo de células A549 y NCI-H23 utilizando el kit de ensayo de hierro (MAK025, Sigma-Aldrich) de acuerdo con el manual de operación.

Fe²⁺ ensayo

Detectamos niveles de hierro divalente en cada grupo de células A549 y NCI-H23 aplicando el kit de ensayo de hierro (ab83366, Abcam, Reino Unido) de acuerdo con el manual de operación.

ensayo GSH

Los niveles de GSH en cada grupo de células A549 y NCI-H23 se evaluaron mediante la aplicación de un kit de prueba de GSH (BioVision Inc., Milpitas, CA, EE. UU.) de acuerdo con el manual de operación.

Extracción completa de ARN y PCR en tiempo real

Como los métodos publicados en informes anteriores²³, se aisló el ARN total de cada grupo de células A549 y NCI-H23, respectivamente. Los niveles de ARNm de SLC7A11 y GPX4 se analizaron mediante PCR en tiempo real utilizando Power SYBR™ Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Las condiciones de PCR fueron: 1 ciclo de 2 min a 50°C y 2 min a 95°C, 40 ciclos de 15 s a 95°C y 1 min a 60°C. Las expresiones génicas relativas se normalizaron a GAPDH, y las relativas al calibrador se dieron mediante la fórmula 2^−ΔΔCt. Se usaron los siguientes pares de cebadores para PCR en tiempo real: GPX4 directo 5′-AGA GAT CAA AGA GTT CGC CG-3′, 5′-TTG inverso TCG ATG AGG AAC TGT GG-3′; SLC7A11 adelante 5′-GGA TTG GCT TCG TCA TCA CT-3′, reverso 5′-ATA ATC AAC CCG CGG TAC TC-3′; Directo GAPDH 5′-TGT TCG TCA TGG GTG TGA AC-3′, inverso 5′-ATG GCA TGG ACT GTG GTC AT-3′.

Análisis de transferencia Western

La transferencia de Western se implementó de acuerdo con los procedimientos informados por Fathi et al.²⁴. Extrajimos la proteína de cada grupo de células A549 y NCI-H23 utilizando un tampón de extracción de proteínas RIPA (Beyotime, Shanghai, China). Usando el kit de prueba de proteínas BCA (Beyotime, Shanghái, China), detectamos concentraciones de proteínas. Luego, separamos y electrotransferimos cantidades iguales de proteína (40 μg) de cada muestra a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquear e incubar con los anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios. En el experimento, usamos los anticuerpos de la siguiente manera: anticuerpo anti-SLC7A11 (1:1500, ab175186, Abcam), anti-GPX4 (1:2000, ab125066, Abcam), anticuerpo anti-β-actina (1:1000, ab8227 , Abcam). Finalmente, la detección se realizó por quimioluminiscencia (Millipore Corporation, Temecula, CA, EE. UU.).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó mediante GraphPad Prism Software (Versión 8.0). Los datos obtenidos de cada experimento in vitro se presentaron como media ± desviación estándar. Las diferencias se identificaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey, y PAGS< 0,05 se consideró significativo. Todos los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente.