La espectroscopia de acción cuantitativa revela la sensibilidad de ARPE19 a la radiación ultravioleta a 350 nm y 380 nm

cultura de la tela

La línea celular inmortalizada ARPE-19 se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, MA, EE. UU.) y, después de la detección de micoplasma, se expandió en frascos de cultivo T75 utilizando medio Eagle modificado de Dulbecco complementado 1:1 con soluciones Ham’s F/12 (DMEM F/12, Invitrogen, MA, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FCS, Merck, Alemania). Una vez confluentes, las células se pasaron utilizando tripsina porcina suplementada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, Life Technologies, CA, EE. UU.). Para la exposición a UVR, se sembraron células amelanísticas ARPE-19 en placas de 96 pocillos con paredes negras (µClear, Greiner Bio One Ltd, Alemania) y electrodo integrado (96w20idf, Applied BioPhysics, NY, EE. UU.) a una densidad de 30 000 células por fosa . Las células se mantuvieron en confluencia durante al menos 28 días antes de la exposición UVR en DMEM con 4,5 g L⁻¹ glucosa, piruvato de sodio 1 mM y FBS al 1 % para permitir una organización coherente del citoesqueleto y la formación de una barrera epitelial^24.25.

exposición UVR

En la «Información complementaria S1» se proporciona una descripción completa de la exposición a la UVR y los cálculos. Brevemente, la cuantificación de UVR a intervalos de 1 nm se realizó utilizando un espectrorradiómetro de doble monocromador SR9910-v7 UV-Vis (Irradian Limited, Elphinstone, Reino Unido) equipado con una guía de luz y un conjunto de sensor planar corregido por coseno. La placa de cultivo se irradió dentro de una incubadora de cultivo de tejidos dedicada (Hera Cell, Heraeus, Alemania), mantenida a 37 °C, 5 % de CO_dos y 100% de humedad, con un haz no colimado a 19 cm de la abertura de la guía de luz de la fuente UVR, una lámpara de epifluorescencia de haluro metálico de mercurio de 120 W (Excelitas Technologies Corp., NY, EE. UU.). Las exposiciones ocurrieron durante 72 h a tres niveles de irradiación, uno a máxima intensidad (irradiación total) y dos con filtros de densidad neutra de ø21,3 mm (ND 0,2 y ND 0,4 (ThorLabs Inc., NJ, EE. UU.)) montados dentro de un pozo de cultivo compartimiento del filtro (Fig. 1). Para cada exposición, se colocó un control negativo (oscuro), que consiste en un disco sólido de resina negra, en una de las posiciones de filtro disponibles. La comparación de las dosis experimentales típicas de energía UVR usadas en el presente estudio y la dosis estimada de UVR terrestre confirmó que las dosis de UVR usadas en el presente estudio alcanzaron la paridad con el rango de dosis de UVR experimentada por una persona dada a lo largo de su vida (ver “Suplementario Datos S1”).

Viabilidad celular

El análisis de viabilidad celular se realizó utilizando PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se eliminó el medio de cultivo y se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Merck, MA, EE. UU.) que contenía cloruro de calcio y magnesio (denominado en este documento como PBS^+/+). Después del lavado, un pocillo de las células de control oscuras se expuso a tampón de lisis celular (RIPA Lysis and Extraction Buffer, Thermo Scientific, MA, EE. UU.) durante 5 min a temperatura ambiente para que actuara como control positivo. Luego, 120 µL de dilución 1:10 de PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, MA, EE. UU.) y PBS^+/+ se añadió a cada pocillo expuesto. Luego, las células se incubaron a 37 ° C y 5% CO_dos durante 20 min para permitir que se desarrolle el ensayo. Después de la incubación, se transfirieron 100 µl del reactivo desarrollado a una placa de ensayo blanca sólida de 96 pocillos y se leyó la fluorescencia con un lector de placas multimodal (Ex 520 nm/Em 580 nm; GloMax Explorer, Promega, WI, EE. UU.).

Detección de impedancia de sustrato de celda eléctrica (ECIS)

Las células ARPE-19 se sembraron en un cultivo ECIS que comprendía 96 pocillos, cada uno de los cuales contenía 20 electrodos interdigitados de 300 µm (96W20Eidf, Applied Biophysics, NJ, EE. UU.). Inmediatamente antes de la exposición a la UVR y después de la maduración del tejido, se instaló la placa de electrodos en una estación ECIS de 96 pocillos. Las medidas espectrales de impedancia eléctrica (Z), resistencia (Ω) y capacitancia (C) entre 500 Hz y 64 kHz se determinaron a intervalos de 11 minutos durante la exposición UVR.

Pintura celular y análisis de imágenes.

Dentro de las 2 h de la exposición a la UVR, las células se procesaron para obtener imágenes de la siguiente manera: un volumen igual de solución de carboxi-H2DCFDA (Invitrogen, MA, EE. UU.) diluido 1:500 en solución salina equilibrada de Hank (HBSS; Sigma-Aldrich, MI, EE. UU.) se añadió al medio de cultivo in situ y se mezcló suavemente mediante trituración para dar una dilución final de 1:1000 de carboxi-H 2 DCFDA. A continuación, las células se incubaron con la solución de tinción durante 30 min a 37 °C. Durante la incubación, una segunda solución de tinción que comprende Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, MI, EE. UU.) diluido 1:500, CellMask Orange (Invitrogen, MA, EE. UU.) diluido 1:500, MitoTracker Deep Red FM diluido 1:500 y yoduro de propidio ( Sigma-Aldrich, MI, EE. UU.) diluidos 1:1500 se combinaron en HBSS. Durante los últimos 10 minutos de la incubación de 30 minutos, se añadió un volumen igual de la segunda solución de tinción a la primera solución en los pocillos. A continuación, se incubó a 37 °C durante 10 min más. Cuando se completó toda la tinción, se realizaron lavados al 50 % por triplicado usando HBSS.

Las imágenes en vivo se realizaron utilizando un microscopio automatizado desarrollado para imágenes de alto rendimiento (Operetta, PerkinElmer, MA, EE. UU.), cuya cámara de imágenes se mantuvo a 37 °C y 5 % de CO_dos durante toda la captura de la imagen. Se capturaron diecisiete campos por pocillo con un aumento del objetivo de 40X (consulte la Fig. 2 para obtener imágenes representativas de las sondas fluorescentes).

El análisis de imágenes se realizó utilizando la suite de análisis de imágenes Columbus (PerkinElmer, MA, EE. UU.). Los parámetros determinados incluyeron número de celdas, intensidad de fluorescencia, análisis de textura (texturas de borde de silla de montar (SER)) y morfología STAR (propiedades de simetría, compacidad umbral, propiedades axiales, propiedades radiales y perfil) para cada compartimento celular. Después de la cuantificación de imágenes por lotes, todos los datos se exportaron como un archivo de texto para su análisis en Excel 2016 (Microsoft Systems, CA, EE. UU.) y R-studio²⁶.

Curación de datos y análisis estadístico

Los datos de PrestoBlue (Invitrogen, MA, EE. UU.) se escalaron entre controles «oscuros» positivos (lisados) y negativos (sin UVR) utilizando la fórmula: \(\left( {\left( {\chi – MIN} \right)/\left( {MAX – MIN} \right)*100} \right)\) donde ‘χ’ se refiere a la medición individual, ‘MIN’ se refiere al valor más bajo dentro del conjunto de datos y ‘MAX’ se refiere al valor más alto. De manera similar, los datos de ECIS se escalaron entre controles positivos (sin células) y negativos (sin UVR) antes de normalizarse al tiempo cero (t₀). Siempre que fue posible, se utilizaron datos de impedancia, resistencia y capacitancia para modelar Rb [tight-junction integrity]α [electrode coverage & cell adhesion] y centímetros [membrane capacitance] valores (denominados colectivamente como RbA) como se describe anteriormente^27.28.

Para modelar la eficiencia del daño UVR en cada longitud de onda utilizando datos de PrestoBlue (Invitrogen, MA, EE. UU.), se utilizó la viabilidad celular procesada para cada longitud de onda y en cada irradiancia (irradiancia total, ND02 y ND04) para calcular los coeficientes de regresión lineal. , cuyo coeficiente de pendiente es indicativo de la eficiencia de daño UVR. Como las pendientes calculadas eran todas negativas, primero se elevaron al cuadrado para poder trazarlas logarítmicamente y normalizarlas a la longitud de onda visible de 405 nm.

El modelado de eficiencia de fotodaño utilizando ECIS se realizó eligiendo primero una «acción común» para todas las longitudes de onda como una disminución del 60% en los parámetros electrostáticos (Z, Ω, C) de sus valores originales. Observando el momento en que se logra la acción definida, junto con el conocimiento de la irradiancia de la fuente de luz, se puede calcular la dosis de fotones necesaria para realizar la acción. El recíproco de la dosis necesaria para cumplir la acción:\(\left( {{\text{i}}. {\text{e}}.\;eficiencia = \frac{1}{dosis}} \right)\)—a cada longitud de onda proporcionó un espectro de acción para cada uno de los parámetros electrostáticos. Estos espectros de acción luego se normalizaron a 405 nm para proporcionar un contexto sobre los efectos de la radiación visible.

Los datos de imagen de alto contenido se calcularon por longitud de onda, luego se normalizaron al control UVR sin «oscuridad» antes de producir el espectro de acción. Como se describió anteriormente, se realizó un análisis de regresión lineal sobre los resultados de las tres condiciones de irradiancia (irradiancia total, ND02, ND04) para cada longitud de onda y el coeficiente de pendiente utilizado para determinar la eficiencia de la respuesta. Cada exposición se replicó tres veces para cada condición de irradiancia con cuatro repeticiones técnicas presentes para cada longitud de onda.

El conjunto de datos se simplificó utilizando el agrupamiento de K-means, complementado con el modelo de consenso basado en la simulación de Monte-Carlo, facilitado por el paquete R M3C¹¹proporcionar una justificación empírica para el valor ideal de ‘K’

Todos los análisis estadísticos se realizaron con R-Studio²⁶ y Excel 2016 (Microsoft Systems, CA, EE. UU.), con datos derivados de tres réplicas biológicas, cada una con cuatro réplicas técnicas.