Enfoque único basado en espectrometría de masas para estudiar cambios específicos en el ADN después de la replicación

Un nuevo método para estudiar cambios específicos en el ADN después de la replicación ha sido publicado como informe técnico en Biología celular de la naturaleza. Los investigadores desarrollaron un enfoque basado en espectrometría de masas cuantitativa de alta sensibilidad llamado iDEMS (DNA Isolation by EdU Labeling for Mass Spectrometry).

Lo nuevo en nuestro trabajo es que no utilizamos métodos de secuenciación ampliamente utilizados en este campo, sino que utilizamos espectrometría de masas, que es la primera vez que se utiliza este enfoque para medir las modificaciones del ADN en el ADN replicado y purificado».

El Dr. Stewart-Morgan, coautor del informe, del laboratorio Groth en el Centro de Investigación de Proteínas (CPR) de la Fundación Novo Nordisk en la Universidad de Copenhague.

Este enfoque único es el resultado de un proyecto conjunto con el laboratorio Hajkova en el MRC London Institute of Medical Sciences (LMS). “En el laboratorio de Groth, tenemos experiencia en replicación y el laboratorio de Hajkova tiene experiencia en el estudio de la metilación del ADN por espectrometría de masas. Creo que esta colaboración multidisciplinar es una gran parte del éxito del proyecto”, explica la doctora. Stewart-Morgan. «Los resultados de nuestra investigación con iDEMS son definitivos y abren nuevas vías para futuras investigaciones».

Modificaciones del ADN y estabilidad celular.

El genoma es el conjunto completo de instrucciones de ADN que se encuentran en una célula. Prácticamente todas las células de un organismo contienen la misma información genética, pero los genes que se expresan se basan en la función de la célula. Esta celda específica la expresión génica está regulada por el epigenoma de la célula, que consta de proteínas unidas al ADN, así como modificaciones químicas directas al ADN. Uno de los reguladores epigenéticos más importantes es la metilación del ADN, un marcador químico que desactiva regiones del genoma que no deberían expresarse. El patrón de estos marcadores es muy importante para mantener la estabilidad y la identidad de una célula: por ejemplo, la metilación del ADN en una célula hepática será diferente del patrón de metilación del ADN en una célula sanguínea.

Cuando el ADN se replica durante la división celular, las marcas epigenéticas asociadas con el ADN, incluida la metilación del ADN, se diluyen. Las hebras de ADN recién creadas necesitan restablecer el nivel y el patrón de metilación para mantener el control de la expresión génica, la estabilidad genómica y la memoria epigenética de la identidad de la célula.

Sin embargo, se desconoce mucho sobre este proceso, y la pérdida de la metilación del ADN es una característica común en las células que se han dividido muchas veces, como las células cancerosas que son altamente proliferativas y las células envejecidas que se han replicado muchas veces a lo largo de la vida de una persona. En los últimos años, varios grupos han intentado investigar este proceso utilizando métodos de secuenciación, pero la cinética exacta del mantenimiento de la metilación posterior a la replicación sigue sin estar clara.

Restauración de la metilación

Usando iDEMS, los investigadores encontraron que los niveles de metilación del ADN aumentaron constantemente después de la replicación, y después de 4 horas, los niveles en el ADN replicado y el ADN genómico eran iguales. Esto indica que este proceso procede a un ritmo constante y lento. Sin embargo, es superado por la división celular.

«Con el tiempo, las células no tienen suficiente tiempo para restaurar su metilación después de la replicación, y la metilación del genoma finalmente se diluye. Esta es la primera vez que se muestra una cinética muy clara para la restauración de la metilación. Además, vimos una cuantificación absoluta de la metilación del ADN. niveles, permitiéndonos distinguir qué marcas de metilación se establecieron recientemente. Esto nos dio confianza en nuestras mediciones cinéticas», informa el Dr. Stewart-Morgan.

Un segundo marcador químico

Los investigadores también utilizaron iDEMS para estudiar un segundo marcador, la hidroximetilación del ADN, que es un marcador genómico mucho más raro que la metilación. Sus resultados corroboraron investigaciones previas, dice el Dr. Stewart-Morgan: «Encontramos que una hebra de ADN, la plantilla o hebra ‘padre’, siempre tiene más hidroximetilación que la otra hebra ‘hija’, lo que respalda trabajos previos que indicaron que este marcador distingue las hebras de ADN según la edad», dice. .

«Sin embargo, también descubrimos que no hay un punto en el que los niveles de hidroximetilación sean iguales entre las hebras parentales y las hijas a lo largo del ciclo celular. Esto abre nuevas preguntas sobre cómo las células podrían usar esta diferencia entre las hebras, por ejemplo, durante reparación del ADN».

El potencial de iDEMS

Al cuantificar directamente las modificaciones del ADN en el ADN replicado, iDEMS resuelve la cinética de metilación e hidroximetilación del ADN después de la replicación del ADN. «iDEMS es una herramienta dinámica e informativa para abordar cuestiones importantes en el mantenimiento del epigenoma y la biología de la modificación del ADN», dice el Dr. Stewart-Morgan.

Mirando hacia el futuro, iDEMS será útil para perfilar la dinámica de metilación e hidroximetilación en diferentes contextos celulares, incluido el envejecimiento y la progresión del cáncer. En comparación con los datos de secuenciación, la espectrometría de masas proporciona una lectura simple y rápida y, por lo tanto, iDEMS puede ser útil donde la eficiencia es clave, como en entornos médicos y estudios de descubrimiento de fármacos.

«Nuestros resultados resaltan la importancia de los nuevos métodos para comprender la biología a través de más de una lente. iDEMS es extremadamente flexible, ya que puede combinarse con otros métodos establecidos que se usan en biología molecular para observar el epigenoma. Por lo tanto, este método agrega una importante herramienta al conjunto de tecnologías que investigan la estabilidad del epigenoma», concluye el Dr. Stewart-Morgan.