¿Qué es la microscopía de fluorescencia?
En un microscopio convencional, la luz visible se usa para iluminar y producir imágenes ampliadas de una muestra.
Por el contrario, la microscopía de fluorescencia tiene una fuente de luz más intensa que excita una especie fluorescente en una muestra. Esta especie fluorescente emite una longitud de onda más larga de menor energía, produciendo imágenes ampliadas.
La microscopía fluorescente puede visualizar detalles específicos de micromuestras y mejorar las características 3D a pequeña escala.
¿Qué es la microscopía de iluminación estructurada (SIM)?
La microscopía de iluminación estructurada (SIM) es una de varias técnicas utilizadas en la microscopía de fluorescencia.
En la microscopía de iluminación estructurada, los patrones de iluminación cambiantes proporcionan diferentes imágenes que pueden producir cortes ópticos y superresolución (resolución más allá del límite de difracción).
La microscopía de iluminación estructurada surgió hace dos décadas y ha evolucionado con varios métodos para generar patrones de microscopía de iluminación estructurada y procesar datos de imágenes. En comparación con la microscopía de disco giratorio confocal, la microscopía de iluminación estructurada tiene mejores capacidades de corte óptico, mayor resolución y menor costo de implementación.
La alta relación señal-ruido (SNR), la velocidad y las bajas intensidades de luz de excitación hacen que la microscopía de iluminación estructurada sea ideal para la obtención de imágenes en 3D de muestras vivas.
Cómo se producen las imágenes 3D en la microscopía de iluminación estructurada convencional (SIM)
En la microscopía de fluorescencia, la información sobre la intensidad en toda la muestra se adquiere y se ubica en una ubicación específica en un espacio 3D para producir imágenes 3D. Sin embargo, con la microscopía de iluminación estructurada, las imágenes 3D se crean tradicionalmente recopilando una secuencia de imágenes seccionadas ópticamente mientras se mueve la muestra axialmente a través de una pila Z. Esta técnica produce distintos cortes XY de la muestra que se pueden unir para crear una imagen 3D.
Aunque esta técnica todavía se usa ampliamente en la microscopía de fluorescencia, tiene algunas desventajas, que incluyen una exposición prolongada a la luz, un tiempo de adquisición prolongado y una posible perturbación de la muestra.
Alternativas a la técnica convencional de microscopía de iluminación estructurada (SIM)
La microscopía de plano multifocal es prominente entre los enfoques alternativos, en los que se elimina la necesidad de movimiento de la muestra al generar imágenes simultáneamente en múltiples planos de imagen con enfoque desplazado.
Esto se puede lograr utilizando varios métodos, por ejemplo, utilizando una matriz de divisores de haz para obtener imágenes de múltiples planos focales en un detector solitario. Este método es compatible con varios objetivos de microscopio. Sin embargo, la construcción necesaria de un conjunto divisor z y la separación de los planos de la imagen debido al sistema óptico no es ajustable sin cambiar las dimensiones críticas del divisor z.
Se utilizó por primera vez un método multidetector con dos cámaras, donde cada cámara colocada en diferentes posiciones focales en relación con la lente del tubo del microscopio podía capturar imágenes en diferentes planos focales. Otros investigadores han extendido esta idea a la microscopía de localización 3D, aumentando el número de detectores. Sin embargo, el alto costo de las cámaras científicas limita la viabilidad de las imágenes multicámara.
Posiciones de los planos de detección borrosas desde el plano de iluminación
Este estudio identifica los efectos adversos de la multiplexación del plano focal en un sistema de microscopía de iluminación estructurada 2D y ofrece técnicas para abordar estos problemas.
Colocar las posiciones del plano de detección borrosas desde el plano de iluminación de un patrón de microscopía de iluminación estructurada 2D complica la usabilidad de imágenes de múltiples cámaras. El aumento de la borrosidad de los planos de detección hace que el contraste de los patrones de iluminación espacial de alta frecuencia se deteriore rápidamente.
El aumento de las distancias de desenfoque también puede producir artefactos no deseados, como un aumento fluctuante y distancias de desenfoque que dependen del índice de refracción del medio.
¿Qué se está logrando con este estudio?
Los investigadores demostraron que se pueden lograr cuatro modos de imagen distintos a través de un sistema de detección de cuatro cámaras utilizando el método de microscopía de iluminación estructurada.
El estudio establece la técnica en la que no se requiere manipulación física del sistema óptico para pasar de un modo a otro, lo que permite versatilidad en la imagen, ya que diferentes muestras necesitan modos específicos para obtener las mejores imágenes.
Esto también proporciona la mejor solución para mover células vivas, obtener una secuencia de imágenes 3D a lo largo del tiempo y producir una película 3D.
Los investigadores visualizaron los movimientos mitocondriales en células vivas, la estructura neuronal en larvas de Drosophila y hasta 130 m de profundidad en tejido cerebral de ratón.
Se adquiere una pila Z de imágenes 3D para muestras estáticas con una extensión axial sustancial, lo que produce una imagen 3D de alta resolución axial y, al mismo tiempo, reduce cuatro veces la cantidad de movimiento de la muestra.
Se obtiene un mosaico de imágenes 3D para una muestra grande, produciendo imágenes con un gran campo de visión (FOV) e información axial valiosa. La misma configuración también puede realizar imágenes multicolores.
El procesamiento de microscopía de iluminación estructurada mejoró significativamente la resolución de las cámaras de 357 nm a 253 nm cuando se usa un objetivo 30/1.05 NA. Los investigadores también proporcionaron una plataforma de software de código abierto para el procesamiento de imágenes para todos estos modos de imagen, junto con las herramientas MATLAB e ImageJ.
Referencia
Johnson, KA, Noble, D., Machado, R. y Hagen, GM (2022). Microscopio de iluminación estructurada multiplano flexible con un detector de cuatro cámaras. fotónica. https://www.mdpi.com/2304-6732/9/7/501
