PicoRuler: las reglas moleculares basadas en proteínas permiten probar la resolución óptica de los últimos métodos de microscopía de superresolución en biomoléculas en el rango inferior a 10 nanómetros en condiciones realistas. (Imagen: Gerti Beliu / Universität Würzburg, erstellt mit DALL·E 3)
Nota del editor: usted y/o sus asistentes robóticos están explorando un nuevo mundo donde existe vida. Estás tratando de comprender tu genómica básica, tu estructura celular y otros aspectos de tu construcción más básica. Está muy lejos de casa y necesita información para enviar a casa, pero también para orientar sus investigaciones y estudios de laboratorio in situ. Tener un dispositivo tricorder/sensor portátil que pueda recopilar esta información y transmitirla a su base para crear imágenes de súper alta resolución puede ser una gran herramienta. ¿Cómo equiparemos a nuestros exploradores humanos y robóticos con sistemas de imágenes para estas misiones en equipo fuera del sitio?
Los nuevos métodos de microscopía de superresolución alcanzan ahora una resolución óptica del orden de unos pocos nanómetros. Esto corresponde a una resolución en el rango de tamaño de las moléculas celulares. Sin embargo, todavía no ha sido posible verificar la resolución realmente alcanzada en componentes celulares como los complejos multiproteicos, porque no existían sistemas de referencia biomoleculares que pudieran marcarse con colorantes en posiciones definidas con precisión a una distancia de unos pocos nanómetros.
Un equipo dirigido por la Dra. Gerti Beliu y el profesor Markus Sauer del Centro Rudolf Virchow – Centro de Bioimagen Integrativa y Traslacional de la Julius-Maximilians-Universität (JMU) Würzburg en Baviera, Alemania, ha proporcionado un punto de inflexión. En la revista Advanced Materials presentan nuevas reglas moleculares biocompatibles, PicoRulers (Protein-based Imaging Calibration Optical Rulers).
Utilizando la expansión del código genético y la química de clics, el equipo pudo construir estas reglas moleculares personalizadas. Se pueden utilizar como estructuras de referencia biomoleculares precisas en microscopía de fluorescencia.
Diseño de un PicoRuler basado en PCNA para microscopía de superresolución inferior a 10 nm. a) Representación del dibujo de la regla PCNA, que muestra las posiciones de tres fluoróforos idénticos a intervalos de 6 nm. Esto se logró mediante el etiquetado bioortogonal de ncAA, que se introdujeron específicamente en PCNA a través de GCE. Como muestra de referencia utilizamos PCNA etiquetado con DOL ≈0,4. b) SDS-PAGE que ilustra la pureza de WT PCNA después de cada paso de purificación. L: escalera de proteínas, His: después de la cromatografía de afinidad con níquel, Strep-Trap: después de la cromatografía de afinidad Strep-tag y SEC: después de la cromatografía de exclusión por tamaño. La banda del monómero PCNA está marcada por un triángulo rojo. c) PCNA-6 (S186Norb) fotografiado por TEM bajo tinción negativa con acetato de uranilo. d) Cromatograma SEC de PCNA-6 (S186Norb) después del marcaje con H-Tet-Cy5, que confirma la conjugación exitosa de los fluoróforos con la proteína PCNA. La fracción que contiene el PicoRuler etiquetado se muestra sombreada en azul. Barra de escala 5 nm (c) – Materiales avanzados
Obra maestra tecnológica: precisión a nivel molecular
Los PicoRulers se basan en la proteína de tres partes PCNA (antígeno nuclear de células proliferativas), que desempeña un papel central en la replicación y reparación del ADN. Al introducir con precisión aminoácidos no naturales en posiciones definidas con precisión, esta proteína se ha modificado de tal manera que se pueden hacer clic específicamente en ella con tintes fluorescentes u otras moléculas con un error de unión mínimo.
Esto permite a los investigadores probar la resolución de los últimos métodos de microscopía de superresolución con una precisión sin precedentes en una biomolécula celular definida con precisión.
Markus Sauer está entusiasmado: “La capacidad de resolver estructuras biológicas reales hasta menos de 10 nanómetros marca una nueva era en la obtención de imágenes biológicas. En comparación con las macromoléculas artificiales utilizadas hasta ahora, nuestros PicoRulers no solo se caracterizan por su compatibilidad biológica. También permiten una precisión incomparable para probar la resolución en condiciones realistas”.
Abriendo la puerta a la investigación de procesos complejos en las células
La aplicación de esta tecnología va mucho más allá de los límites tradicionales de la microscopía. «Nuestros PicoRulers no son sólo una herramienta para mediciones más precisas, sino que también abren la puerta a una investigación más profunda y detallada de procesos complejos que ocurren dentro de nuestras células», explica Gerti Beliu.
Evaluación fotofísica de PicoRulers basados en origami de PCNA y ADN. a, b) Imágenes dSTORM seleccionadas de PicoRulers (a) y origami de ADN (b) con triple etiqueta (DOL ≈ 3.0) con distancias interfluoroforales de 6 nm, junto con sus muestras de referencia etiquetadas individualmente (Ref). Aunque cada origami de ADN contiene un único fluoróforo, la muestra de referencia de PCNA exhibe un DOL ≈0,4 y, por lo tanto, también contiene moléculas de PCNA sin etiquetar y con doble etiqueta (tamaño de píxel de 2 nm). Barras de escala, 10 nm. c) Ocurrencia relativa de tiempos de vida de estado apagado (tiempo de apagado), número de estados activados detectados (eventos) de PicoRulers individuales en experimentos dSTORM y número de eventos (ubicaciones) detectados por cuadro en función del tiempo (análisis de huellas dactilares). d) Imágenes FLIM de PicoRulers etiquetados con clic H-Tet-Cy5 (la referencia etiquetada individualmente se muestra en gris y el PicoRuler con triple clic en un cuadro magenta) medidas mediante imágenes confocales TCSPC en tampón de fotointerruptor a una intensidad de irradiación de ≈ 2,5kWcm-2. Para minimizar el fotoblanqueo de los fluoróforos, se registraron imágenes FLIM con un tiempo de integración de 25 µs por píxel. No se aplicó ningún límite de intensidad. Barras de escala, 2 μm. e) Caídas de fluorescencia promedio de PCNA PicoRulers etiquetados con uno (gris) o tres (magenta) fluoróforos Cy5. f) Relaciones Nc/Nl,av determinadas para moléculas de PCNA de referencia marcadas individualmente y PicoRulers triplemente marcadas en experimentos antiagrupación de fotones (n = 13) – Materiales avanzados.
Gran potencial para futuras aplicaciones
Un mayor desarrollo de PicoRulers podría alterar las imágenes biológicas y médicas con resolución molecular a largo plazo. Por primera vez permiten validar y mejorar el potencial de resolución de nuevos métodos de microscopía de superresolución en muestras biológicas. Esto los convierte en una herramienta valiosa para el futuro esclarecimiento de la organización molecular y la interacción de biomoléculas en las células.
PCNA como nanorregla basada en proteínas para imágenes de fluorescencia por debajo de 10 nmMateriales Avanzados (acceso abierto)
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