La disminución de la expresión de TFF2 y la disminución de la glicosilación de αGlcNAc son biomarcadores malignos del adenoma de la glándula duodenal pilórica

Pacientes

El presente estudio evaluó muestras de tejido de 22 pacientes con neoplasia de la mucosa duodenal no ampular con diferenciación de la glándula pilórica en el Hospital Universitario de Keio. Todas las muestras se obtuvieron mediante disección submucosa endoscópica (ESD) y se fijaron en formalina tamponada al 10% y luego se incluyeron en parafina. El diagnóstico anatomopatológico de adenoma de glándula pilórica (APG) se realizó con base en cortes teñidos con hematoxilina y eosina (H&E), según los criterios de clasificación de la OMS.²³. La AGP se clasificó como de bajo o alto grado; Brevemente, la presencia de una relación núcleo/citoplasma alta, nucléolos prominentes, numerosas mitosis, núcleos que se extienden hacia la luz y/o pérdida de polaridad nuclear de las células tumorales era indicativo de alto grado.²⁴. La mayoría de las muestras de PGA contienen una serie de lesiones de alto y bajo grado. Al revisar las secciones teñidas con H&E, se seleccionaron las lesiones de bajo y/o alto grado más obvias en cada caso para su posterior análisis. Las características clínicas de los 22 casos de PGA se muestran en la Tabla 1.

Inmunohistoquímica

La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando una tinción Bond-MAX automatizada (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania). Antes de la inmunotinción, la recuperación del antígeno se realizó en tampón Tris-HCl 10 mM (pH 9,0) que contenía EDTA 1 mM. Los anticuerpos primarios utilizados para la inmunohistoquímica fueron anti-αGlcNAc (clon HIK1083, IgM de ratón, Kantokagaku, Tokio, Japón) diluido 1/100, anti-MUC2 (clon Ccp58, IgG de ratón, Novocastra, Newcastle, Reino Unido) diluido 1/200, anti-MUC5AC (clon CLH2, IgG de ratón, Novocastra) diluido 1/100, anti-MUC6 (clon CLH5, IgG de ratón, Novocastra) diluido 1/200, anti-TFF2 (clon 2A10, Novus Biologicals, Centennial, CO, EE. UU.) diluido 1/200, anti-p53 (clon DO-7, IgG de ratón, DAKO) diluido 1/2000, anti-MIST-1 (clon D7N4B, IgG de conejo; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) diluido 1/100 , anti-pepsinógeno-1 (clon 8003 (99/12), IgG de ratón; Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) diluido 1/100 y anti-H⁺/K⁺-ATPasa (clon 1H9, IgG de ratón; MBL, Nagoya, Japón) diluida 1/100. Se realizaron experimentos de control negativo omitiendo los anticuerpos primarios del procedimiento de inmunotinción y no se encontró tinción específica.

La inmunohistoquímica dual con anti-TFF2 y anti-αGlcNAc se realizó utilizando un tinte automatizado Bond-MAX. TFF2 se detectó usando DAB, un sistema basado en peroxidasa de rábano picante (ImmPress; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) y αGlcNAc se detectó usando Fast Red, un sistema basado en fosfatasa alcalina (N-Histofine Simple Stain, Nichirei Bioscience, Tokio, Japón).

Semicuantificación de la proteína central de mucina, αGlcNAc, TFF2, MIST-1, pepsonigeno-1 y H⁺/K⁺-Expresión de ATPasa

La evaluación de la expresión de las proteínas mucinas centrales y αGlcNAc y TFF2 se realizó en función de la proporción de células neoplásicas teñidas positivamente en relación con el número total de células neoplásicas en cada lesión de PGA de bajo o alto grado y luego se clasificó de 0 a 3. donde 0 representa <10% de las células tumorales; 1 representa entre el 11 y el 33% de las células tumorales; 2 representa del 33 al 66% de las células tumorales; y 3 representa más del 66% de las células tumorales, como se describió previamente^{14,15.dieciséis}. Luego se calculó la proporción de αGlcNAc o TFF2 a MUC6 para las 40 lesiones.

Los resultados de la tinción de p53 se clasificaron en difuso, de tipo salvaje y con pérdida de expresión. El patrón de tipo salvaje se caracteriza por una expresión heterogénea débil.

MIST-1, pepsinógeno-1 y H⁺/K⁺-La expresión de ATPasa se evaluó como la proporción de células neoplásicas teñidas positivamente en relación con el número total de células neoplásicas en todas las lesiones de PGA, incluidas las bajas y las altas, y luego se clasificó de 0 a 3, como se describió anteriormente.^{14,15.dieciséis}.

Estadísticas

Las puntuaciones de expresión semicuantitativa para cada marcador de mucina MUC5AC, MUC6 y αGlcNAc y para TFF2 se analizaron estadísticamente utilizando la prueba de pares emparejados de Wilcoxon. También se analizó la diferencia en las proporciones de TFF2 o αGlcNAc a la puntuación de expresión de MUC6 entre lesiones de PGA de alto y bajo grado. PAG valores < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los análisis se realizaron utilizando el software Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, EE. UU.). Los gráficos de violín se crearon utilizando el software JMP (JMP Statistical Discovery LLC, Cary, NC, EE. UU.).

Aprobación ética

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por los Comités de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, Tokio, Japón (no. 20180074). Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.