Imágenes de fluorescencia de por vida para estudiar la compactación del ADN y las actividades genéticas
(a) Esquemas de enfoques de etiquetado dirigidos a dominios de cromatina replicantes en fase S temprana e intermedia. El protocolo de etiquetado se ajustó para segregar los territorios de los cromosomas marcados para facilitar el análisis de imágenes. (b) y (c) detección FLIM del índice de refracción de la cromatina y detección FLIM-FRET de la compactación del ADN, respectivamente. Crédito: por Svitlana M. Levchenko, Artem Pliss, Xiao Peng, Paras N. Prasad y Junle Qu
Los estudios de la compactación del ADN genómico en el núcleo celular y la reorganización dinámica durante los procesos fisiológicos o el desarrollo de enfermedades en entornos de células vivas son un gran desafío. Esta complejidad se debe al alto grado de compactación requerido para acomodar ~ 2 metros de ADN genómico dentro del núcleo celular, que típicamente tiene de 5 a 10 micrómetros de diámetro. Además, la densidad de empaquetamiento de la cromatina no es estática sino que fluctúa con el tiempo, acomodando las actividades del gen. Mientras tanto, la resolución 3D de la microscopía óptica no es lo suficientemente alta, incluso para las modalidades de imágenes de sub-difracción, lo que limita los estudios de la geometría espacial de la arquitectura genómica compleja y sus transformaciones dinámicas.
(a) Imágenes representativas de la vida útil de la fluorescencia de los sitios de replicación del ADN en etapa temprana, media y tardía marcados con AlexaFluo 546. (b) Imagen codificada por colores de la distribución de la vida en todo el núcleo celular. (c) Esquemas del enfoque FLIM para medir la compactación de cromatina que se replica en diferentes ventanas de fase S. (d) Vida media de fluorescencia de AlexaFluo546 utilizada para marcar sitios de replicación de ADN de fase S tempranos, intermedios y tardíos. Las barras de error corresponden a desviaciones estándar. Los datos indican el índice de refracción más alto y, por lo tanto, la densidad de empaquetamiento más alta para los dominios de cromatina pobres en genes que se replican en la fase S tardía en comparación con la cromatina rica en genes replicada en la fase S temprana. Crédito: Svitlana M. Levchenko, Artem Pliss, Xiao Peng, Paras N. Prasad y Junle Qu
En un nuevo artículo publicado en Luz: ciencia y aplicaciones, un equipo de científicos, dirigido por el profesor Junle Qu del Centro de Óptica Biomédica y Fotónica y la Facultad de Física e Ingeniería Optoelectrónica de la Universidad de Shenzhen, China, y el Prof. Paras N. Prasad del Instituto de Láseres, Fotónica y Biofotónica de la Universidad Estatal de Nueva York, Buffalo, EE. UU., Ha desarrollado una estrategia alternativa basada en imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM) para superar las limitaciones existentes de los enfoques convencionales. Los autores proponen dos ensayos FLIM independientes que permiten mediciones precisas de la compactación del ADN. El primero se basa en la relación cuadrática inversa entre la vida útil de la fluorescencia de las sondas fluorescentes incorporadas en el ADN y su índice de refracción local, que es variable debido a la densidad de compactación de la cromatina. Otro enfoque FLIM emplea la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre los nucleótidos marcados con fluorescencia incorporados en las cadenas de ADN.
(a) Esquema de enfoque: las células cultivadas marcadas secuencialmente con CldU en la fase S temprana y con IdU en la fase S tardía se siguieron en las generaciones de células posteriores, lo que permite visualizar territorios cromosómicos segregados con cromatina marcada en fase S temprana y tardía teñida. La segregación de etiquetas permite el análisis de la compactación de cromatina en territorios cromosómicos individuales. (bc) Las células se fijaron a varios intervalos después de la exposición a nucleótidos halogenados y se tiñeron (b) para CldU (AlexaFluor 546, verde) y (c) IdU (AlexaFluor647, rojo) como se muestra en el panel (a). Intensidad de fluorescencia representativa (be), imágenes de por vida (f) y eficiencia FRET (gh) del proceso de formación del territorio cromosómico después de marcar dominios de cromatina de replicación de fase S tempranos y tardíos. Las áreas FRET altas (rojas) indican una proximidad cercana entre las fibras de cromatina replicadas en la fase S temprana y tardía. Crédito: Svitlana M. Levchenko, Artem Pliss, Xiao Peng, Paras N. Prasad y Junle Qu
En este estudio, ambos ensayos FLIM se validaron en células cultivadas, donde los investigadores compararon la compactación de dominios de cromatina ricos en genes que se replican en la fase S temprana y aquellos que se replican en la fase S intermedia a tardía y no contienen predominantemente secuencias codificantes. Los datos obtenidos demuestran la sensibilidad de ambos ensayos FLIM y revelan una diferencia significativa en la compactación de grupos de ADN genómico ricos y pobres en genes. Muestran que el ADN rico en genes está empaquetado de forma suelta en comparación con los dominios de ADN densos que carecen de genes activos.
Svitlana M. Levchenko et al, Imágenes de fluorescencia de por vida para estudiar la compactación del ADN y las actividades genéticas, Luz: ciencia y aplicaciones (2021). DOI: 10.1038 / s41377-021-00664-w
Proporcionado por
Academia china de ciencias
Cita: Imágenes de duración de fluorescencia para estudiar la compactación del ADN y las actividades genéticas (2021, 27 de diciembre) tomadas el 27 de diciembre de 2021 de https://phys.org/news/2021-12-fluorescence-lifetime-imaging-dna -compaction.html
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